制限酵素はどう見つかったか。大腸菌の防御からEcoRIの「のりしろ」まで

遺伝子工学の歴史シリーズは、科学系ポッドキャストの日への参加をはさんで、今回から本編に戻ります。前回は、大腸菌に感染するウイルスであるバクテリオファージの話でした。

前回の話の要点は、大腸菌がファージに殺されるだけでなく、ファージのDNAを切る酵素「制限酵素」を持っているという点です。あきさんは、このDNAを切る酵素こそが遺伝子工学の出発点になったと位置づけます。

「制限」という名前は、文字どおりファージの増殖を制限する現象から来ています。ある株の大腸菌で増やしたファージを、別の株の大腸菌にかけると、ほとんど増えなかったのです。

この現象について、スイスの研究者ヴェルナー・アーバーヴェルナー・アーバー ── スイスの微生物学者・遺伝学者。細菌がファージのDNAを切って身を守る「制限」と、自分のDNAを守る「修飾」のしくみを研究しましたさんたちは、大腸菌自体がファージのDNAを切り刻んでいるのではないかと考えました。ただし、この段階ではまだ酵素は見つかっておらず、現象から立てた仮説でした。

仮説が裏づけられたのは1968年です。アメリカのマシュー・メセルソンさんとロバート・ユアンさんが、大腸菌からこの酵素を取り出すことに成功しました。

この成功によって、制限酵素がバクテリオファージの遺伝子を切り刻んでいたことが証明されます。ファージの増殖が抑えられる現象は、やはり酵素の仕事だったのです。

ところが、このとき見つかった制限酵素は、遺伝子工学の道具としては使い物になりませんでした。今の研究でDNAを切り貼りするときに使う制限酵素は、切る場所が決まっています。

それでも、DNAを切る酵素が実在するとわかったことには大きな意味がありました。道具として使える酵素が見つかるのは、もう少し先の話です。

話を進める前に、あきさんは少し時間をさかのぼり、ファージの種類を説明します。ファージには、感染するとすぐに増えて大腸菌を壊し、周りへ一気に広がるタイプがいます。

一方で、細菌の中で眠るタイプのファージもいます。眠るタイプのファージは、自分のDNAを細菌のDNAの中に入り込ませます。

細菌が分裂するたびに、入り込んだファージのDNAも一緒にコピーされます。この状態を溶原化溶原化 ── ファージのDNAが宿主細菌の染色体に組み込まれ、すぐに増殖せず細菌と一緒に複製される状態。条件がそろうと再び増殖を始めますと呼びます。

溶原化したファージは、細菌の中でずっと身を隠しています。そして何かのきっかけで目を覚まし、細菌の中で増えて、細菌を破って出てきます。

あきさんは、人間のウイルスにも似た例があると紹介します。エイズの原因となるHIVは、自分の遺伝子情報を感染した人の染色体の中に潜り込ませ、何年もひっそりと眠ります。

HIVもある時に目覚めて患者さんの体の中で増え、体を壊していきます。眠るタイプのファージは、HIVと同じような戦略を使っているわけです。

眠るファージの現象を詳しく調べたのは、フランスのアンドレ・ルヴォフアンドレ・ルヴォフ ── フランスの微生物学者。溶原化の研究などで、1965年にジャコブ、モノーとともにノーベル生理学・医学賞を受賞しましたさんです。1950年頃の研究で、後にノーベル賞を受賞しています。

前回触れた接合の実験からも、もう一つ手がかりが得られていました。眠っているファージのDNAは、大腸菌の染色体上の特定の決まった場所に必ず入り込んでいたのです。

1962年から1963年頃、アメリカのアラン・キャンベルさんが、ファージDNAの組み込みモデルを提唱します。ファージのDNAはいったん輪っかの形になり、その輪っかが細菌の染色体の決まった場所で切れてつなぎ込まれる、という考え方です。

キャンベルさんのモデルも、まだ予測の段階でした。研究者たちは、このつなぎ込みをどんな酵素が行っているのかを考え始めます。

ここで登場するのが、アメリカのジョンズ・ホプキンス大学で微生物学を研究していたハミルトン・スミスさんです。スミスさんは、最初から制限酵素を追っていたわけではありませんでした。

スミスさんが解明しようとしていたのは、ファージのDNAが細菌のDNAにどう組み込まれるのかというしくみです。サルモネラ菌とP22というファージを使い、組み込みに関わる遺伝子を見つけて、その働きを試験管の中で再現しようと考えていました。

この分野には競合する研究者も多くいました。スミスさんはインフルエンザ菌という細菌を使い、ファージのDNAを組み込ませてから細菌を潰し、ファージのDNAだけを取り出す実験を、大学院生のケント・ウィルコックスさんに任せます。

ところが、ファージが感染したはずのDNAが取り出せません。ウィルコックスさんは、細菌の中でファージのDNAが壊されている、つまり制限が起きているのではないかとスミスさんに伝えました。

後から調べると、ウィルコックスさんの見立てどおり、インフルエンザ菌の中でファージのDNAは壊されていました。この制限は、DNAの「とろみ」を手がかりに確かめられます。

まず、インフルエンザ菌の細胞を壊して抽出液を取り出します。この抽出液には制限酵素も含まれていると考えられました。

長いDNAの溶液は、とろとろした強い粘りのある液体です。ファージのDNAに抽出液を混ぜると、そのとろみがなくなり、DNAが壊されていることがわかりました。

逆に、インフルエンザ菌自身のDNAに抽出液を混ぜても、とろみは変わりませんでした。インフルエンザ菌の抽出液には、自分のDNAは壊さずにファージのDNAだけを壊す何かがあると考えられたのです。

その後、スミスさんの研究室にトーマス・ケリーさんが加わります。ケリーさんたちは、インフルエンザ菌の抽出液に含まれる酵素が、DNAのどこを切っているのかを調べました。

DNAはA、G、T、Cの4つの塩基塩基 ── DNAを構成する部品のうち、遺伝情報の「文字」にあたる物質。アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）の4種類がありますでできています。調べた結果、この酵素は決まった6文字の配列がある場所で必ずDNAを切ることがわかりました。

狙った場所で切れるなら、DNAを加工する道具に使えます。インフルエンザ菌の酵素は、切る場所が決まった制限酵素として初めて発見されたものでした。

同じジョンズ・ホプキンス大学のダニエル・ネイサンズさんが、この酵素に注目します。ネイサンズさんはSV40SV40 ── サルに感染するウイルスの一種。DNAが小さく扱いやすいため、分子生物学の初期研究でよく使われましたというサルのウイルスを研究していました。

SV40は非常に小さなDNAを持ち、その配列は決まっています。ネイサンズさんは、SV40のDNAに、見つかったばかりの制限酵素HindIIを作用させました。

HindIIが認識する6文字の配列は、SV40のDNAの中に何か所かありました。たとえば切る場所が5か所あれば、SV40のDNAはいろいろな長さの断片に分かれます。

DNA断片は、電気泳動電気泳動 ── 電気を使って、DNAなどの分子を大きさごとに分ける手法。ゲルの中では小さい分子ほど速く移動しますという手法を使うと大きさごとに分けられます。毎回決まった大きさの断片が出てくるので、それぞれがウイルスのどこに当たるかを調べれば、SV40のDNAの地図を作れるようになりました。

最初の発見をきっかけに、他の研究者たちもさまざまな細菌から制限酵素を探し始め、次々に新しいハサミが見つかります。その中であきさんが特に紹介するのが、EcoRIです。

EcoRIは、GAATTCというDNAの6文字の並びを見つけて切ります。あきさんは、時間がある人は紙に書いてみてほしいと呼びかけます。

DNAは2本の鎖でできており、GはCと、AはTとペアになります。GAATTCの下に相手の鎖を書くと、上の鎖を左から読んでも、下の鎖を右から読んでもGAATTCになる、回文構造回文構造 ── DNAの2本の鎖で、それぞれを決まった向きから読むと同じ配列になる構造。多くの制限酵素はこうした配列を認識して切りますになっています。

EcoRIは、この配列の真ん中でスパッと切るわけではありません。上の鎖も下の鎖も、それぞれ最初のGとAの間で切るため、切り口にAATTという「のりしろ」が飛び出します。

この飛び出した切り口は、突出末端突出末端 ── DNAの2本の鎖がずれて切られ、片方の鎖が1本鎖のまま飛び出した端。相補的な配列どうしがくっつきやすく、粘着末端とも呼ばれますと呼ばれます。とみーさんの「出っ張ってる端っこってことだ」という言葉に、あきさんもうなずきます。

EcoRI以外にも、のりしろを作る制限酵素はさまざまな配列で見つかっています。あきさんは、のりしろを作る制限酵素の発見が、遺伝子工学が発展していく一番最初のきっかけになったと話します。

あきさんは、制限酵素の使い道の例を挙げます。人間のDNAをEcoRIで切り、酵素の遺伝子を取り出して、大腸菌のプラスミドプラスミド ── 細菌の染色体とは別に存在する小さな環状DNA。外から遺伝子を組み込み、細菌に運び込む「運び屋」としてよく使われますに組み込んで大腸菌に送り込むと、人間の酵素を大腸菌の中で作れるようになります。

人間の細胞培養はお金がかかり、変な菌が入り込んで細胞が死んでしまうこともあります。細胞はいろいろな栄養を要求するため、手間もかかります。

大腸菌は安価な培地で簡単に増えます。そのため、細胞を使うよりはるかに安いコストで酵素を作ることができ、あきさんはこれを「非常に大進歩」と表現しています。

1978年、アーバーさん、スミスさん、ネイサンズさんの3人はノーベル生理学・医学賞を受賞します。受賞理由は、制限酵素の発見と、それを分子遺伝学に応用したことでした。

あきさんは、3人の仕事が順番につながっていたと整理します。アーバーさんがしくみを見抜き、スミスさんが狙った場所で切る酵素を見つけ、ネイサンズさんがその酵素でDNAの地図を描きました。

ただし、のりしろでDNAどうしがくっついても、それだけではまだのり付けされていない状態です。切れ目をつなぎ止める酵素が必要になります。

切れ目をつなぎ止める酵素はリガーゼと呼ばれます。次回は、DNAをつなぐ「のり」であるリガーゼの話に進みます。

まとめ

制限酵素は、細菌がファージから身を守るしくみとして見つかり、狙った場所で切れる酵素の発見とEcoRIののりしろによって、DNAを切り貼りする遺伝子工学の道具へと変わっていきました。

• 「制限」は、ある株の大腸菌で増やしたファージが別の株で増えない現象で、アーバーさんたちはファージのDNAを切る酵素の存在を考えた
• 1968年に大腸菌から取り出された最初の制限酵素は、DNAをどこでも切り刻むため道具には使えなかった
• ファージの組み込みを研究していたスミスさんの実験から、決まった6文字の配列で切るHindIIが見つかった
• ネイサンズさんはHindIIと電気泳動でSV40のDNA地図を作り、EcoRIはつなぎ合わせに使えるのりしろを作った
• 1978年、アーバー、スミス、ネイサンズの3人がノーベル賞を受賞し、次の主役はDNAをつなぐリガーゼになる